ONT · MinION · Oxford Nanopore
在家進行全基因體定序
How I Sequenced My Genome at Home
完整重點整理
$1,100
單次 Run 成本
Per run variable cost
4 h
親手操作
Hands-on time
72 h
全程完成
Start to finish
單一 flow cell · ~30 Gb 產出 · ~10x whole-genome coverage
動機 · Motivation

為什麼在家定序？

→好奇與可操控感——把生物學變成可親手拆解、重建的系統，如同玩 Raspberry Pi 或 Jetson Nano
→理解家族遺傳風險——作者家族有自體免疫疾病高風險，希望透過基因體資料接近答案
→親手理解工作流程——不只看報告，而是掌握每一步的目的與失敗模式
! 重要提醒
這不是醫療診斷流程。發現令人擔心的訊號，應交由合格臨床專業人員以正式檢驗資料判讀，不能直接用於臨床決策。
技術原理 · Nanopore Technology

Nanopore 定序原理

→Flow cell 內含約 2,000 個 protein pores（蛋白質奈米孔）；DNA 穿孔時電流變化由神經網路還原為 A/C/G/T 序列
→Reads 長度可達數萬 bases，遠超 short-read 定序的約 150 bp，對困難區域、結構變異更有優勢
→一個 flow cell 跑 48 小時可產生約 30 Gb 資料；人類基因體約 3.2 Gb → 約 10× coverage
→若支援甲基化模型，5mC／5hmC methylation calls 可直接存於 BAM tags，無需額外建庫
臨床等級變異判讀門檻：通常建議 ≥ 30× coverage · 10× 適合常見 variants 初步探索
策略 · Flow Cell Strategy

單一 Flow Cell 兩種用法

比較項目Option A　全基因體淺覆蓋Option B　Adaptive Sampling
Coverage~10×~30–50× (目標區域)
目標範圍全基因體指定 panel（BED file）
Target size 建議—<1% 基因組最理想
稀有變異偵測不夠穩妥較有信心
panel 設計難度低（不需要）需 BED + FASTA 一致
適合情境粗略全基因體探索藥物基因、HLA、自免位點
Adaptive sampling：先讀 ~500 bases 比對 reference，不符合目標即反轉電壓 eject，節省資源
成本 · Equipment & Reagents

設備與耗材一覽

項目估計成本說明
MinION Mk1D~$3,200可重複使用的定序儀
R10.4.1 Flow Cell (FLO-MIN114)~$900每次 run 一片，單次使用
SQK-LSK114 Ligation Kit~$100/rxn連接式建庫套組
NEBNext Companion Module v2~$55/rxnEnd repair & ligation 酵素
Monarch T3010 gDNA Kit~$3/樣本頰黏膜 DNA 抽取
Flow Cell Wash Kit~$17/次中途 wash／reload
零星耗材（tips、tubes 等）~$50LoBind tubes、PBS、乙醇
真正的單次變動成本約 $1,100 · 多數試劑以實驗室規模包裝，對只做一次的人會有明顯浪費
流程 · Workflow Overview

六大實驗步驟

01 Setup & Pore Check安裝 MinKNOW · flow cell 回溫 20 min · 確認活性孔 ≥800 準備
02 DNA Extraction頰拭子 → 離心 → T3010 protocol · Elution Buffer 預熱 60°C ~30 min
03 Library PreparationEnd repair → Bead cleanup → Adapter ligation → 第二次 cleanup ~70 min
04 Flow Cell LoadingPriming → 上樣 · 最怕 bubble 進入 flow cell 高風險
05 Sequencing & MonitoringMinKNOW 設定 · 監控 pore occupancy、translocation speed 48 h
06 Basecalling & AlignmentDorado HAC/SUP · minimap2 · samtools · mosdepth QC 分析
Wet Lab · 建庫關鍵細節

Library Prep 最常踩雷的地方

✕ AMPure beads 過度風乾
30 秒足矣——太久會龜裂並黏死管壁，造成不可逆 DNA 損失。
✕ 第二次 cleanup 用 ethanol
必須用 Long Fragment Buffer（LFB），乙醇會破壞 adapter 上的 motor protein。
! 酵素 mix 不可 vortex
含 glycerol 的酵素液 vortex 後起泡降低活性，應以輕彈方式混合。
! Ligation Buffer 很黏稠
需慢慢 pipette-mix，否則看似混合其實仍分層，影響連接效率。
✓ 理想產物
15 µL 中含 150–450 ng library；12 µL 上機，其餘備用作 reload。
定序 · Sequencing & Monitoring

上機最怕空氣；監控三指標

✕ 最高風險：bubble 進入 flow cell
回抽 storage buffer 不超過 30 µL · 加液要慢 · 見氣泡立即停止抽除再繼續。建議先完整看過 ONT 官方 loading tutorial video。
監控指標正常範圍異常處理
Pore occupancy隨時間下降≤30% 可 nuclease wash + reload
Translocation speed~400 bases/sec突然下降 → pore 狀態變差
Read length distribution頰細胞 ~4 kb 峰值反映 DNA 片段品質
MinKNOW 設定：Kit SQK-LSK114 · Flow cell FLO-MIN114 · Dorado HAC v5.2.0 即時 basecalling
分析 · Basecalling & Alignment

Basecalling 策略與後處理工具鏈

模型Per-base accuracy速度建議使用時機
HAC~99%快·可即時跑Run 當下全程使用
SUP~99.5%慢（GPU ×4–5）事後對重點區域重跑
→minimap2 — Nanopore reads alignment 到 GRCh38
→samtools sort / index / flagstat — 預期 >95% mapped
→mosdepth — target region depth QC；adaptive sampling panel 富集確認
→最終 aligned.bam 可延伸做：variant calling、HLA phasing、藥物基因分型、AlphaGenome 功能推測
NVIDIA GPU 平台：HAC 約快 5× · SUP 約快 4× · 單 run 資料量：pod5 ~49 GB + BAM ~6 GB + logs ~1 GB
評估 · Who Is This For?

適合誰？有哪些限制？

✓ 適合族群
→想親手理解定序流程，不只看報告的人
→對特定基因體區域有明確問題，想用 adaptive sampling 做 targeted analysis
→具備 wet-lab 基礎、能處理冷鏈、QC 與資料分析的研究者
✕ 主要限制
成本
Flow cell $900 + 大包裝試劑浪費，單次成本高
Coverage 偏淺
單一 flow cell whole-genome 通常只有 ~10×
無 DNA QC 儀器
缺 Qubit 時，故障排除極困難
若目的是臨床診斷或高置信度罕見變異偵測，單次居家 run 並非最穩妥路徑